Цель - разработать и внедрить программу медико-генетического консультирования, пренатальной диагностики и инвазивных процедур в семьях при применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Согласно данным литературы оптимальным временем выявления зиготности является период новорожденности. Анализ происхождения близнецов может проводиться по совокупности признаков: акушерских, пренатальных, ультразвуковых (УЗ), патологоанатомических и др. На первом этапе определяется пол плодов или детей. Разнополые дети всегда дизиготны (ДЗ). При совпадении пола новорожденных в 25% случаев двойня монозиготная (МЗ), в остальных наблюдениях - ДЗ. Далее проводится оценка хориальности согласно постулату, что монохориальная (МХ) двойня всегда МЗ. Затем изучаются плаценты и межамниотические мембраны. В более поздние сроки, если в семье возникает необходимость определения зиготности, прибегают к иным методам тестирования. При молекулярно-генетическом тестировании определение зиготности близнецов проводится методом установления биологического родства с использованием анализа микросателлитных ДНК-повторов. Аллельные варианты маркеров, формирующих генотип, обусловлены различным количеством повторяющихся фрагментов. Высокая степень полиморфизма этих участков ДНК практически исключает возможность полного совпадения генотипов двух индивидуумов по всем полиморфным локусам. Исключением являются лишь МЗ близнецы, у которых генотипы идентичны. Подобное исследование является наиболее точным для определения зиготности. ДНК-тестирование связано как с положительными, так и отрицательными моментами. К положительным относится малое количество биологического материала, необходимое для исследования, и его разнообразие: кровь, плацента, волосы, ногти, биологические жидкости и др. Кроме того, стабильность ДНК позволяет провести исследование в случае смерти близнеца даже внутриутробно, когда ДНК может быть выделена из тканей, законсервированных в парафиновых блоках. К отрицательным сторонам относятся стоимость исследования и опасения пациентов о неразглашении генетической информации при ДНК-тестировании.

Нами сформирована группа из 18 пациенток для пренатального проведения ДНК-теста на зиготность (таблица).

Таблица – Результаты определения хориальности и зиготности при беременности двойней

По хориальности 9 наблюдений были МХ, 7 - ДХ и в 2-х - установить хориальность не удалось. Всем пациенткам выполнен забор биологического материала из 2-х амниотических мешков при проведении диагностического амниоцентеза в сроке гестации 16-21 неделя.

Для молекулярно-генетического анализа применяли метод идентификации биологического родства на основе количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (КФ-ПЦР) с использованием ДНК-маркеров пяти хромосом (13, 18, 21, Х и Y), отличающихся наиболее выраженным полиморфизмом. Метод КФ-ПЦР заключается в амплификации коротких тандемных повторов ДНК (STR), расположенных на исследуемой хромосоме или сцепленных с изучаемым геном. Использование в ПЦР специальной флуоресцентной метки позволяет идентифицировать количество аллелей STR-маркеров при разделении на капиллярном электрофорезе и точно определять дозу каждого фрагмента ДНК гена или хромосомы. Если диапазоны длин аллелей не перекрываются, возможно использование флуоресцентной метки одного цвета; если диапазоны длин аллелей перекрываются, то необходимы различные красители, что позволяет интерпретировать результаты анализа не только по размеру аллелей, но и по их цвету.

Этот метод может применяться для диагностики числовых хромосомных аномалий, для диагностики крупных генных дупликаций и делеций, а также определения родительского происхождения хромосом.

При определении зиготности в нашем исследовании в 10 случаях беременность оказалась МЗ: во всех 9 наблюдениях МХ двойни и в одном - ДХ.

Клинический пример (наблюдение 2). По результатам ДНК-анализа с использованием 15 маркеров определено, что плоды женского пола имели одинаковый генотип; это свидетельствует об их происхождении из одной зиготы. На рисунке представлены генотипы двойни женского пола по маркерам хромосом 13, 18, 21, Х.

Рисунок — Генотипы двойни женского пола по маркерам хромосом 13, 18, 21, Х

Клинический пример (наблюдение 3). По результатам ДНК-анализа с использованием 15 маркеров определено, что плоды мужского пола имели одинаковый генотип; это свидетельствует об их происхождении из одной зиготы.

Клинический пример (наблюдение 5). По результатам комбинированного скрининга у одного плода из двойни риск хромосомной патологии составил 1:26. Для определения наличия хромосомной патологии плода и зиготности использовали 15 микросателлитных маркеров хромосом 13, 18, 21, X, Y. По результатам ДНК-анализа хромосомная патология была исключена у обоих плодов мужского пола. По 11 из 15 микросателлитным маркерам плоды имели разный генотип, что дало основание считать их происходящими из разных зигот (ДЗ).

Высокая идентификационная информативность ДНК-типирования позволила установить в первом случае одинаковый генотип у двух плодов женского пола по всем исследуемым маркерам, что свидетельствует об их происхождении из одной зиготы; во втором случае одинаковый генотип у двух плодов мужского пола по всем изучаемым маркерам, что свидетельствует об их происхождении из одной зиготы и в третьем случае - разный генотип у двух плодов мужского пола, что дало основание считать их происходящими из разных зигот.

В 6 наблюдениях ДХ двоен подтверждена ДЗ. Кроме того, в двух клинических наблюдениях (6 и 8) при УЗ-осмотре не удалость однозначно установить хориальность, тем самым предположить зиготность и определить прогноз потомства для плодов. При молекулярно-генетическом исследовании установлено ДЗ-происхождение близнецов в обоих случаях.