Цель исследования - разработать метод выявления ДНК микромицетов (дерматофитов, дрожжеподобных грибов, маласейзий) в соскобах кожи с использованием метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

В качестве биологического материала используют соскобы поверхностного эпителия кожи пациентов. Для получения соскобов используют ложку Фолькмана. Полученный материал помещают в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл транспортной среды («ВекторБест», РФ). При отсутствии возможности выполнения дальнейших исследований в течение ближайших 5 ч, пробирки замораживают и оставляют для хранения при температуре -18 °С.

Для выделения микробной ДНК из соскобов кожи пациентов используют наборы для выделения нуклеиновых кислот «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ).

Выделенную ДНК используют для постановки ПЦР-РВ с целью выявления микроорганизмов: Candida albicans (C. albicans), Candida glabrata (C. glabrata), Candida parapsilosis (C. parapsilosis), Epidermophyton floccosum (E. floccosum), Malassezia furfur (M. furfur), Malassezia restricta (M. restricta), Malassezia оbtusa (M. оbtusa), Malassezia globosа (M. globosa), Malassezia sympodialis (M. sympodialis), Malassezia pachydermatis (M. pachydermatis), Trichophyton rubrum (T. rubrum), Thrichophyton interdigitale (T. interdigitale).

В пробирку для амплификации вносят: 15,0 мкл 2Х Quick-LoadTaqMasterMix; 1,1мкл смеси эквивалентных концентраций праймеров (прямого и обратного) и зонда для идентификации исследуемого микроорганизма (таблица 1); 1,1 мкл смеси эквивалентных концентраций праймеров (прямого и обратного) и зонда для house-keepingгена GAPDH; 4,8 мкл воды и 8 мкл ДНК.

В качестве флуоресцентной метки для зондов при идентификации микромицетов используют флуорофор FAM, в качестве гасителя - BHQ1. Детекцию производят по каналу «Green». В качестве метки для зонда для house-keepingгена GAPDH используют флуорофор JOE, в качестве гасителя - BHQ2. Детекцию данного гена выполняют по каналу «Yellow».

Таблица - Последовательности праймеров и зондов для идентификации микромицетов (дерматофитов, дрожжеподобных грибов, маласейзий)

Для амплификации используют программу: 1 цикл: 95 °С - 5 мин; 45 циклов: 95 °С - 20 с, 60 °С - 40 с (амплификатор «RotorGene»).

Флуоресценцию оценивают по каналу «Yellow». При выявлении значений Ct в пределах от 15 до 39 циклов, делают заключение о наличии в исследуемом образце ДНК человека и возможности дальнейшего анализа результатов исследования. При выявлении значений Ct в пределах от 0 до 15 илиболее 39 циклов делают заключение об отсутствии в исследуемом образце ДНК человека и невозможности дальнейшего анализа результатов исследования.

Далее изучают флуоресценцию по каналу «Green». При выявлении значений Ct в пределах от 15 до 39 циклов делают заключение о наличии в исследуемом материале соответствующего микроорганизма. При выявлении по каналу «Green» значений Ct в пределах 0-14 циклов или 40-45 циклов делают заключение об отсутствии в исследуемом материале соответствующего микроорганизма.

Предложенный способ обеспечивает возможность точной идентификации Candida albicans, Candida glabrata, Candidapa rapsilosis, Epidermophyton floccosum, Malassezia furfur, Malassezia restricta, Malassezia оbtusa, Malassezia globosа, Malassezia sympodialis, Malassezia pachydermatis, Trichophyton rubrum, Thrichophyton interdigitale в соскобах кожи.

Для пациентов с атопическим дерматитом и экземой тяжелые и длительно и часто рецидивирующие формы течения заболевания ассоциированы с присутствием на коже патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Быстрый и достоверный метод выявления некоторых микромицетов в соскобах кожи обеспечит возможность точного установления диагноза и назначения таргетной терапии.

Способ выявления ДНК дерматофитов, дрожжей и малассезий в соскобах с пораженной кожи : рационализаторское предложение № 161/1 : утв. ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» 10.01.2019 / Т. В. Руденкова, Н.А. Милькото, С. А. Костюк, И.Г. Шиманская.