Цель исследования - сравнительный анализ наборов реагентов для выделения ДНК из периферической крови; подбор специфических участков генов, контролирующих синтез нейромедиаторов (дофамин, серотонин) и нейропептидов (субстанция Р, нейрокинин А), оптимизация состава амплификационной смеси и программ амплификации.

В качестве биологического материала следует использовать клеточную массу крови. Использование в таком качестве образцов цельной крови является низкоинформативным, так как происходит ингибирование ПЦР, связанное с наличием детергентов, лактоферина, гемоглобина, а также плазмы, содержащей ингибирующие ионы или низкомолекулярные соединения.

Для выделения ДНК из периферической крови пациентов использовали наборы реагентов «Проба-НК» («ДНК-технология», РФ), «АртДНКMiniSpin» («АртБиоТех», РБ) и «Экстракция-100» («Вектор-Бест», РФ). В качестве референсного применялся метод фенол-хлороформной экстракции с использованием TRIzol-реагента («Invitrogen», США).После выделения ДНК из образцов периферической крови с помощью различных наборов реагентов спектрофотометрически определяют степень чистоты выделенной ДНК по показателю А260/280, а также концентраций ДНК.

Количественные данные представлены в виде медианы и размаха Ме (min/max). Для решения задачи сравнения двух независимых групп количественных переменных применялся критерий Манна-Уитни. Критическим уровнем значимости принят p<0,05.

Установлено, что при пробоподготовке с использованием стандартной фенол-хлороформной экстракции А260/280 составил 1,86 (1,82/2,01); «Проба-НК» - 1,72 (1,68/1,74); «АртДНКMiniSpin» - 1,82 (1,79/1,85); «Экстракция-100» - 1,81 (1,77/1,86). Концентрации выделенной ДНК составили 610,16 (588,91/680,65) мкг/мл для «Проба-НК»; 810,37 (764,15/885,66) мкг/мл - для «АртДНКMiniSpin»; 796,81 (739,74/890,46) мкг/мл - для «Экстракция-100»; 805,77 (750,07,74/891,68) мкг/мл - для TRIzol. Установлены статистически значимые различия в степени чистоты (Z = -6,851, p = 0,307) и концентрации выделенной ДНК (Z = -6,911, p = 0,416) при использовании «Проба-НК» и TRIzol.

На основании статистического анализа для выделения ДНК из периферической крови рекомендуется использование наборов реагентов «АртДНКMiniSpin» и «Экстракция-100».

Дизайн олигонуклеотидов осуществляют поэтапно для каждого гена и последовательно для каждого выбранного гомологичного участка c использованием бесплатного программного онлайн-приложения Primer3 v. 0.4.0 и бесплатного онлайн-алгоритма mfold/DNAfold.Анализ наличия вероятных гомо- и гетеродимероволигонуклеотидных праймеров проводят с использованием встроенного алгоритма Vector NTI - OligoDuplexes. Специфичность подобранных наборов олигонуклеотидных праймеров осуществляют с использованием онлайн-приложения NCBI/Blast.

Выделенную ДНК используют для ПЦР-анализа с целью выявления полиморфизма генов транспортера серотонина, дофамин-β-гидроксилазы и препротахикинина с использованием подобранных пар праймеров (таблица).

Таблица - Последовательности праймеров для изучения полиморфизма генов транспортера серотонина, дофамин-β-гидроксилазы и препротахикинина

Состав реакционной смеси для выявления полиморфизма гена транспортера серотонина: 1 мкл геномной ДНК (50 мкг/мкл), 0,4 мкл каждого праймера (5 мМ), 0,2 мклTaq полимеразы (1 Ед/мкл), 5 мклMaster-Mix, 13,0 мкл DEPC; конечный объем - 20 мкл. Программа амплификации: 95 °С 3 мин; 35 циклов - 95 °С 45 с, 66 °С 60 с, 72 °С 60 с; 72 °С 7 мин.

Состав реакционной смеси для выявления полиморфизма гена дофамин-β-гидроксилазы:1 мкл геномной ДНК (20 мкг/мкл), 0,4 мкл каждого праймера (5 мМ), 0,2 мклTaq полимеразы (5 Ед/мкл), 5 мклMaster-Mix, 13,0 мкл DEPC; конечный объем - 20 мкл. Условия термоциклирования: 94 °С 30 с; 35 циклов - 94 °С 30 с; 60 °С 30 с; 72 °С 30 с; 72 °С 2 мин.

Состав реакционной смеси для выявления полиморфизма гена препротахикинина: 1 мкл геномной ДНК (25 мкг/мкл), 0,4 мкл каждого праймера (5 мМ), 0,2 мклTaq полимеразы (1 Ед/мкл), 5 мклMaster-Mix, 13,0 мкл DEPC; конечный объем - 20 мкл. Условия термоциклирования: 95 °С 1 мин; 30 циклов - 95 °С 40 с; 60 °С 45 с; 72 °С 40 с; 72 °С 5 мин.

Детекцию результатов генотипирования осуществляют методом горизонтального гель-электрофореза в 2,5 % (для гена транспортера серотонина) и 3,0 % (для генов дофамин-β-гидроксилазы и препротахикинина) агарозном геле.

В основе формирования хронической мигрени и хронической головной боли напряженного типа лежат различные генетически опосредованные факторы. Изучение роли полиморфизма генов медиаторов нейротрансмиттерных систем будет способствовать уточнению патогенеза заболевания (изучение взаимоотношения генотип-фенотип), разработке прогностических критериев развития осложнений и индивидуализации терапии.