Актуальность исследования: основной (по «щелочному» значению изоэлектрической точки, pI = 9,8) фактор роста фибробластов, или ФРФ-2 - один из базовых инструментов клеточного культивирования, включая технологии стволовых клеток. Семейство ФРФ включает более 20 белков, обладающих мито- и ангиогенной активностью. Низкая стабильность ФРФ-2 (время полуинактивации ~ 9 ч) требует его ежедневной добавки в среду культивирования клеток, что в сочетании с высокой стоимостью фактора делает его лимитирующим компонентом технологий и одновременно объектом генно-инженерного конструирования для прогнозируемого развития клеточной терапии.

ФРФ-2 обладает набором уникальных структурных параметров, отличающих его от «среднестатистического» глобулярного однодоменного белка, включая: 1) отсутствие стабилизирующих белки дисульфидных групп среди 155 аминокислотных остатков; 2) дисбаланс заряженных аминокислот - положительно заряженных остатков лизина и аргинина (в сумме 24 остатка) против 12 остатков дикарбоновых аминокислот - аспарагиновой и глутаминовой.

Структурные особенности ФРФ-2 через пока не установленные механизмы связаны со сниженной функциональной стабильностью белка. Данные физико-химических исследований ФРФ-2 как основа для понимания механизмов его функционирования крайне ограничены, что обусловлено практическим значением ФРФ-2 и доминирующей ролью в исследованиях биотехнологических компаний.

Цель исследования - получение рекомбинантного ФРФ-2 человека, анализ фолдинга и динамики конформаций белка сканирующей калориметрией и флуоресцентной спектроскопией для установления основных детерминант стабильности и активности.

Основное достижение: впервые показаны: доминирующий вклад в стабильность ФРФ-2 зарядовых взаимодействий, компенсирующих отсутствие стабилизирующих дисульфидов; высокая конформационная динамика белка, приводящая к формированию частично разупорядоченного компактного интермедиата фолдинга как основного детерминанта стабильности и функциональной активности ФРФ-2.

Методы. Ген рекомбинантного ФРФ-2 получен сплайсингом - полимеразной цепной реакцией (ПЦР) на основе 24 сконструированных олигонуклеотидов с последующим клонированием гена в плазмиду для экспрессии pET-22b+ («Novagen», США), которую осуществляли в штамме E.coli BL21(DE3).

Спектры флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра СМ-2203 («Solar», Республика Беларусь). Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) выполнена на калориметре ДАСМ-4М («Биоприбор», Российская Федерация) в диапазоне 10-100 °C при скорости нагрева 60 К/ч.

Получение рекомбинантного ФРФ-2. Экспрессия ФРФ-2 в штаммах-продуцентах, оптимизированных по составу основной и вспомогательных плазмид, составляет от 30 до 70 мг белка на 1 л культуры со значительным увеличением выхода при культивировании в биореакторе. Разработан метод очистки, включающий экстракцию нерастворимого ФРФ-2 из телец включения, ренатурацию по оригинальному протоколу конкурентного рефолдинга на ионообменном сорбенте и хроматографию на гепарин-сефарозе. Целевой полипептид имеет молекулярную массу ~17 кДа, соответствующую расчетной, и электрофоретическую чистоту 92-97 %.

Анализ конформации и стабильности ФРФ-2 дифференциальной сканирующей калориметрией.Функциональная активность белков напрямую связана с динамикой структурных состояний как механизмом, обеспечивающим взаимодействие с биологическими лигандами/субстратами. Фактором риска, снижающим стабильность осциллирующего функционального состояния белка, является переход в промежуточные по степени структурной организации состояния белка - конформационные интермедиаты. Адекватный анализ стабильности функционального состояния белков требует описания интермедиатов, условий их формирования либо доказательства их отсутствия.

Конформационные интермедиаты белков доступны для изучения в «предкритических» условиях среды (промежуточные значения рН, концентраций денатурантов, температуры), провоцирующих высокую заселенность интермедиатов за счет частичной дезорганизации структуры белка, но существуют также при физиологических условиях в виде минорной популяции. Эти минорные популяции, тем не менее, фактически определяют стабильность и активность основного (нативного) состояния, снижая его содержание через необратимые превращения интермедиатов - агрегацию и денатурацию.

ДСК представляет собой наиболее информативный подход к описанию третичной структуры белка в растворе через набор количественных термодинамических параметров, адекватно оценивающих сумму структурных взаимодействий. Сканирование ФРФ-2 в ячейке калориметра со скоростью нагрева 1 °С в мин с регистрацией изменения теплоемкости как характеристики структурных взаимодействий белка показывает пик теплопоглощения, отражающий кооперативный переход в развернутое (термоденатурированное) состояние. Интегральная характеристика структурных взаимодействий - калориметрическая энтальпия денатурации Δh, определяемая как площадь под пиком (4,6 кал/г при рН 8, таблица), находится на уровне, характерном для большинства однодоменных белков с полностью сформированной третичной структурой.

Эти данные показывают, что отсутствие стабилизирующих дисульфидных связей в молекуле ФРФ-2 компенсировано взаимодействиями иной природы - зарядовыми, что доказано серией биофизических измерений в диапазоне рН 8-2.

Зарядовые взаимодействия белка по определению более рН-зависимы, чем потенциалы Ван-дер-Ваальса, гидрофобные и водородные связи. При этом наибольшие изменения зарядовых взаимодействий в ФРФ-2 следует ожидать в области рН 3-4 вблизи константы ионизации карбоксильных групп (рКа ~ 3,5).

Таблица - Термодинамическая стабильность рекомбинантного ФРФ-2 в терминах калориметрической энтальпии термоденатурации, Δh и пиковой температуры полуперехода, Т_m.

pH	Тm,°С	Δh, кал/г
8,0	54,5	4,63
7,0	54,0	3,82
6,0	53,0	4,12
5,0	52,0	3,65
4,0	43,0	0,84
3,0	-	0,0

В полном соответствии с данным анализом уже при рН 4 энтальпия денатурации ФРФ-2 уменьшается почти в 6 раз (таблица) до критически низкого значения 0,84 кал/г, что характерно для белков в состоянии «расплавленной глобулы» («molten globule») - компактного денатурированного состояния. Оно характеризуется потерей части структурных взаимодействий при сохранении общей компактности дестабилизированной структуры и гидрофобного «ядра» белка, экранированного от контакта с водным сольвентом.

При рН 3 в условиях, близких к полной потере зарядовых взаимодействий, получена «плоская» кривая теплопоглощения, лишенная пикового перехода, что свидетельствует о разрушении калориметрически регистрируемой третичной структуры ФРФ-2. При этом ФРФ-2 сохраняет часть структурных взаимодействий, достаточную для поддержания общей компактности молекулы, что показывает величина теплоемкости при 20-30 оС, промежуточная между теплоемкостью полностью компактного и полностью развернутого белка.

Данные флуоресцентной спектроскопии подтверждают значительный вклад в стабильность ФРФ-2 зарядовых взаимодействий, что следует из динамики спектральных параметров при рН<5. Динамика связана с удалением основного флуорофора - единственного в молекуле ФРФ-2 триптофана Трп-123 -от внутримолекулярного тушителя флуоресценции в результате потери части структурных взаимодействий без изменения неполярного характера микроокружения флуорофора. В результате гипофлуоресцентная при рН>5 молекула ФРФ-2 становится гиперфлуоресцентной при рН<5 с максимумом эмиссии при 330-332 нм.

Наилучшим индикатором перехода ФРФ-2 в частично разупорядоченный интермедиат служит появление характерной только для последнего доступности гидрофобных кластеров для гидрофобного флуоресцентного зонда АНС (8-анилино-1-нафтилсульфоната). Связывание АНС резко возрастает в узком диапазоне рН от 4,5 до 3, достигая максимума при рН 3 за счет резкого увеличения заселенности интермедиата ФРФ-2.

Основные характеристики интермедиата ФРФ-2 (расплавленной глобулы): потеря части структурных взаимодействий при сохранении компактности третичной конформации и гидрофобного «ядра», экранирующего основные флуорофоры от контакта с растворителем; флуктуация дестабилизированной третичной структуры с экспонированием гидрофобных кластеров, что дает доступ гидрофобному зонду; разобщение Трп-123 и внутримолекулярного тушителя флуоресценции, низкая структурная энергетика белка.

Функциональная активность ФРФ-2 определена по стимуляции роста линии эмбриональных фибробластов мыши 3T3 и находится на уровне активности коммерческих препаратов. При этом концентрация полумаксимальной стимуляции роста клеток С₀₅ = 0,25 нг/мл на 2 порядка меньше концентраций ФРФ-2, используемых для экспансии стволовых клеток. Этот «разрыв» концентраций означает, что активность ФРФ-2 контролируется не магистральным механизмом высокоаффинных белок-рецепторных взаимодействий, а суммой вторичных факторов, включая сниженную операционную стабильность ФРФ-2 как результат формирования структурного интермедиата, впервые описанного в данной работе.