Паразитарные заболевания в настоящее время являются одной из актуальных проблем медицины, что обусловлено их повсеместным широким распространением и существенным социально-экономическим ущербом, наносимым обществу. Подавляющее большинство кишечных протозоозов не имеет характерной клинической картины и специфических симптомов, на основании которых можно было бы эффективно осуществлять дифференциальную диагностику с другими патологическими состояниями инфекционной и неинфекционной природы. Следствием этого часто являются диагностические ошибки, запоздалое и неадекватное для паразитарной инвазии лечение, что, в свою очередь, повышает вероятность развития тяжелых форм паразитарных инвазий и их осложнений.

В Республике Беларусь ежегодно регистрируется заболеваемость населения кишечными протозоозами. Учитывая возможность бессимптомного носительства паразитических простейших, а также активную реализацию водного пути передачи, особую значимость приобретают вопросы использования в клинической лабораторной диагностике, а также при осуществлении эпидемиологического надзора за кишечными инвазиями надежных методов выявления и идентификации этих возбудителей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) как способ обнаружения возбудителей паразитозов в биологическом материале обладает многими преимуществами по сравнению с другими используемыми для этого методами (микроскопическими, серологическими, иммунологическими). Данный метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, объективным количественным учетом, воспроизводимостью результатов, приемлемостью для массовых исследований.

Цель исследования - разработка отечественного набора реагентов для выявления возбудителей протозоозов в биологическом материале методом ПЦР с детекцией продуктов реакции в режиме «реального времени» с улучшенными относительно аналогов технико-экономическими и потребительскими свойствами.

Разработка набора реагентов «Прото-ПЦР/РВ» включала ряд последовательных этапов, начиная с подбора праймеров и заканчивая определением аналитических характеристик набора.

На основании анализа нуклеотидных последовательностей геномов Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica, представленных в базе данных GenBank, были определены диагностически значимые сайты генома возбудителей исследуемых протозоозов и с учетом основных характеристик, влияющих на дальнейшую амплификацию, подобраны специфические пары праймеров и соответствующие гибридизационные зонды.

Оптимизированы условия ПЦР с детекцией продуктов реакции в режиме «реального времени» для выявления фрагментов генома Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum и Entamoeba histolytica: подобран оптимальный температурно-временной протокол амплификации; определены концентрации основных компонентов (праймеров, гибридизационных зондов, Taq-полимеразы, ионов Mg²⁺) в реакционной смеси, обеспечивающие максимальную эффективность реакции; показана целесообразность использования дополнительных компонентов для повышения специфичности реакции и уменьшения возможного ингибирующего влияния примесей, содержащихся в копроматериале.

На основе рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих в качестве вставки выявляемые нуклеотидные последовательности генома исследуемых возбудителей протозоозов, разработан комплект положительных контрольных образцов. Для контроля эффективности выделения генетического материала и реакции амплификации в наборе предусмотрен внутренний контрольный образец.

Изучение аналитических параметров набора реагентов с использованием положительных, отрицательных и стандартных образцов показало отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что указывает на его высокую (не менее 99 %) диагностическую чувствительность и специфичность. Аналитическая чувствительность набора составила 10³ ГЭ/мл для каждого патогена.

Таким образом, разработанный отечественный набор реагентов «Прото-ПЦР/РВ» по своим качественным и количественным характеристикам не уступает зарубежным аналогам.