УДК: 616.3:578.81.083(047.31)(476)
Год издания: 2019

Метод оценки протозооцидной активности дезинфицирующих и антисептических средств с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Фомина Е.Г.Горбунов В.А.Дронина А.М.Гудков В.Г.Карамышева Ю.С.Григорьева Е.Е.Шуманская С.Ю.
Рубрики: 76.03.45
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии
Тема НИР: «Разработать диагностический набор для выявления возбудителей протозоозов методом полимеразной цепной реакции и метод определения протозооцидной активности дезинфектантов и антисептиков для повышения эффективности санитарно-противоэпидемических и профилактических мероприятий».
Сроки выполнения НИР: июль 2016 г. — декабрь 2019 г.
Научный руководитель: канд. мед. наук, доц. В.А. Горбунов, канд. биол. наук Е.Г. Фомина.
Источник финансирования: госбюджет.

Химическая дезинфекция занимает важное место в системе санитарно-противоэпидемических мероприятий и является необходимым условием для осуществления эффективного контроля над распространением паразитарных инвазий за счет прерывания путей передачи возбудителей через объекты внешней среды.

Особенности организации экзогенных (покоящихся) стадий развития простейших обусловливают их высокую устойчивость к разнообразным физическим или химическим воздействиям и способность длительное время персистировать в окружающей среде. Поэтому применение в отношении возбудителей паразитарных болезней дезинфицирующих средств с установленными бактерицидными или вирулицидными свойствами нередко оказывается неэффективным и не гарантирует эпидемиологической безопасности объектов в отношении возбудителей паразитозов. Определение протозооцидной активности дезинфектантов и антисептиков требует специальных лабораторных исследований.

Оценка чувствительности простейших к дезинфицирующим и антисептическим средствам осуществляется с помощью комплексного исследования как in vivo, так и in vitro. При этом предполагается изучение процесса эксцистирования возбудителя, заражение клеточной культуры, использование витальных красителей, микроскопическое исследование материала, иммунофлуоресцентный анализ, обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) для определения специфических генов-мишеней (hsp 70, CP 2, β-tubulin и др.). Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, могут быть использованы как самостоятельно, так и в комбинации с другими описанными методами для объективизации и количественной оценки степени инактивации тест-объектов, что подтверждено исследованиями, посвященными сравнительной оценке и установлению корреляции между применяемыми тестами.

Цель исследования - разработка современного высокочувствительного метода оценки протозооцидной активности дезинфицирующих и антисептических средств.

Из цистных форм простейших ооцисты криптоспоридий являются основным тест-объектом для оценки протозооцидных свойств дезинфектантов и антисептиков в отношении возбудителей протозоозов. Это объясняется их высокой резистентностью к активнодействующим веществам, входящим в состав средств, наиболее часто применяемых для дезинфекции в учреждениях здравоохранения, лабораториях и системах водоочистки, а также низкой инфицирующей дозой для человека и животных.

В качестве тест-объекта (модельной жидкости) была использована суспензия ооцист Cryptosporidium parvum, полученная из копроматериала методом очистки и концентрирования, основанным на применении флотации в насыщенном растворе хлорида натрия. Данный подход позволяет получить очищенный материал, содержащий ооцисты в достаточном количестве, а также частично исключить их дегенерировавшие и мертвые формы.

В ходе исследований отработаны методы выделения генетического материала (РНК) из ооцист криптоспоридий.

В качестве гена-мишени для разработки ПЦР использовали метаболический ген, кодирующий фермент амилоглюкозидазу (CPAG, Cryptosporidium parvum amyloglucosidase), уровень экспрессии которого отражает жизнеспособность возбудителя. Этот фермент является ключевым в утилизации полисахарида амилопектина - основного источника энергии для спорозоитов внутри ооцисты, которая необходима для мобилизации инфицирующих стадий развития в процессе инвазии. На основании анализа нуклеотидной последовательности Cryptosporidium parvum подобрана специфическая пара праймеров и оптимизированы условия ОТ-ПЦР с детекцией продуктов реакции в режиме «реального времени» с применением интеркалирующего красителя Sybr Green.

Показано, что содержание мРНК амилоглюкозидазы соотносится с инфекционной активностью ооцист и отражает ее изменения под воздействием различных химических факторов.

Предложенный метод позволяет оценивать активность дезинфицирующих и антисептических средств на этапе их разработки, государственной регистрации и применения.


Область применения: государственный санитарный надзор, направленный на предотвращение возникновения и распространения паразитарных заболеваний протозойной этиологии.
Рекомендации по использованию: метод предназначен для учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор, специалистов лабораторий, выполняющих работы с условно-патогенными микроорганизмами и патогенными биологическими агентами I–IV групп риска (постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 21.11.2016 № 118 «Об установлении перечня условно-патогенных микроорганизмов и патогенных биологических агентов»), а также специалистов лабораторий, имеющих аккредитацию в области проведения испытаний биоцидной активности дезинфицирующих и антисептических средств.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по указанной тематике, оценка протозооцидной активности дезинфицирующих и антисептических средств.


в начало med.by баннеры учреждения авторы расширенный поиск
Достижения медицинской науки Беларуси.
Copyright © 1997-2020 НИО РНМБ
Вопросы и комментарии просьба отправлять Администратору сайта