Совершенствование эпидемиологического надзора и лабораторного контроля за вирусными инфекциями, связанными с действием внешнесредовых факторов, является актуальной задачей отечественного здравоохранения. К перечню наиболее распространенных возбудителей кишечных вирусных инфекций, для которых характерен контактно-бытовой путь передачи через контаминированные объекты среды обитания человека (ОСОЧ), относятся норовирусы 2 геногруппы (НоВ2), ротавирусы А (РВ А), энтеровирусы (ЭВ).

Исследования, направленные на разработку максимально эффективных способов индикации вирусной контаминации ОСОЧ, остаются сегодня приоритетной проблемой мирового значения. Одним из перспективных подходов к ее решению является создание стандартизованных наборов реагентов на основе принципа «два в одном», предполагающего объединение современной технологии отбора образцов и их пробоподготовки с технологией непосредственной детекции вирусного материала. Данный подход, несомненно, повышает технологичность исследований, а также обеспечивает их стандартизацию и оперативность.

Цель исследования - разработка мультиплексной технологии для улавливания, концентрирования и выявления возбудителей доминирующих кишечных вирусных инфекций (НоВ2, РВ А, ЭВ) и создание на ее основе набора для индикации вирусного загрязнения ОСОЧ.

В качестве вируссорбирующего материала для отбора проб с поверхностей ОСОЧ использовался волокнистый адсорбент отечественного производства марки Фибан. Условия для наиболее эффективного прохождения стадий сорбции/элюции подбирали путем экспериментальной контаминации различных поверхностей (стеклянной, пластиковой, металлической) псевдовирусными частицами (ПВЧ), созданными на основе армированных нуклеиновых кислот, содержащих фрагменты ЭВ и НоВ2. Методом для детекции вирусного материала, собранного с контаминированных поверхностей, выбрана полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и регистрацией продуктов в режиме реального времени. Экспериментально подобраны оптимальные параметры и условия для отбора образцов и их пробоподготовки (концентрирования). Использование сорбента массой 2 г, увлажненного 0,01н раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ), и элюция 3 % бифэкстрактом в объеме 5 мл в течение 30 мин позволили достичь 100 % эффективности процедуры.

Для разработки технологии мультиплексной ПЦР в режиме реального времени были подобраны 4 комплекта праймеров и зондов для детекции ЭВ, НоВ2, РВ А и внутреннего контрольного образца (ВКО). Все праймеры и зонды были локализованы в наиболее консервативных регионах геномов соответствующих возбудителей: в гене РНК-полимеразы НоВ2, в 5’-НТР участке генома ЭВ и в гене NSP3 генома РВ А. Определены оптимальные сочетания диагностических праймеров для детекции возбудителей в мультиплексном формате. На основании экспериментальных результатов сформированы пары комплектов праймеров для детекции различных возбудителей в одной пробирке: РВ А/НоВ2, ВКО/ЭВ. Установлена оптимальная концентрация ионов магния (6,0 mM) и температура отжига праймеров (56 °С) в формате мультиплексной ПЦР.

Разработка комплекта контролей для набора включала создание рекомбинантных векторов, содержащих фрагменты-мишени геномов РВ А, НоВ2 и ЭВ. Для этой цели были сконструированы праймеры, специфичные к фрагментам-мишеням геномов данных возбудителей и содержащие на 5′-концах сайты распознавания для рестрикционной эндонуклеазы HindIII. Полученные вирусспецифические фрагменты были клонированы в составе плазмиды pJET 2.1. Таким образом были получены рекомбинантные векторы pJT2.1/RvA/988-1074NSP, pJT2.1/NoV2/4996-5100, pJT2.1/EV419-565, которые в дальнейшем были использованы в качестве положительных контрольных проб (К+) в составе разрабатываемого набора. Для получения РНК-содержащего положительного контрольного образца (ПКО) была применена технология армированных РНК (АрРНК). В качестве ВКО также был использован препарат АрРНК, полученный в результате экспрессии с вектора pET20b/MS2, содержавшего гены матуразы и капсидного белка бактериофага MS2. Испытания полученного комплекта контролей (К+, ПКО и ВКО) показали, что они могут быть использованы для мультиплексной детекции вирусов-контаминантов ОСОЧ.

Разработанная технология легла в основу создания «Набора мультиплексного для индикации вирусного загрязнения объектов среды обитания человека методом ОТ-ПЦР» (далее - набор). Данный набор предназначен для выполнения всех этапов санитарно-вирусологических исследований смывов с поверхностей ОСОЧ, начиная от отбора проб и концентрирования в них вирусов и заканчивая непосредственной детекцией генетического материала ЭВ, НоВ2 и РВ А. В соответствии со своим назначением он состоит из 2 комплектов: № 1 «Комплект реагентов для получения смывов и элюатов с объектов среды обитания человека» и № 2 «Комплект реагентов для выявления РНК кишечных вирусов методом ОТ-ПЦР (ротавирус А, норовирус II, энтеровирус). Основные контрольные показатели комплекта № 1: эффективность сорбции не менее 99 %, эффективность элюции не менее 90 %; комплекта № 2: аналитическая специфичность 100 %, аналитическая чувствительность выявления РНК РВ А, НоВ2, ЭВ - 10³ ГЭ/мл.

В ходе полевых испытаний разработанного набора выполнены отбор и исследование проб с различных поверхностей в кабинете функциональной диагностики поликлиники и предприятия по переработке рыбы. Всего было исследовано 49 проб. В учреждении здравоохранения РВ А выявлялись в 19,35 %, НоВ2 и АдВ - в 3,2 и 8,45 % случаев соответственно. На поверхностях предметов и объектов производственного предприятия вирусный материал не был обнаружен. Таким образом, показана возможность практического применения разработанного набора и подтверждена эффективность его использования.

В настоящее время набор по ТУ BY 100558032.2019-409 зарегистрирован в Республике Беларусь, получено регистрационное удостоверение (№ ИМ-7.107392 от 28.03.2019).