|
УДК: 616.36-002.14:578.891-078.33
Год издания: 1999
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА ЭКСПРЕССИЕЙ В E. COLI НЕБОЛЬШОГО ФРАГМЕНТА S-СЕГМЕНТА В СОСТАВЕ ВЕКТОРА PJC40
Владыко А.С., Фомин И.К., Счесленок Е.П.
Рубрики: 76.03.41, 76.35.33
Тема НИР: “Разработка современных тест-систем для диагностики клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, СПИДа. Получение рекомбинантного антигена вируса ЛХМ”.
Сроки выполнения НИР: январь 1996 г. - декабрь 1998 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук А.С. Владыко.
Целью настоящих исследований было получение рекомбинантного белка вируса ЛХМ экспрессией консервативного и иммунодоминантного по В-сайту небольшого участка гена, кодирующего белок нуклеокапсида NP в составе плазмиды pJC40. Одной из главных особенностей этой плазмиды является экспрессия белка с включением в его состав 10 гистидиновых аминокислотных остатков. Это дает возможность очистки получаемого в E.coli продукта с помощью металлхелатной хроматографии.
В качестве матрицы для синтеза ДНК-копии интересующего В-сайта был использован концентрированный и очищенный препарат вируса ЛХМ. При расчете и синтезе праймеров для цепной полимеразной реакции (ЦПР) применяли общепринятые компьютерные программы и ДНК-синтезатор БелНИИЭМ. После получения ДНК-амплификата в ЦПР последний был клонирован в плазмиду pJC40 под T7 РНК-полимеразный промотор между Hind III и Bam HI-сайтами рестрикции. Полученный экспрессией плазмиды в E.coli рекомбинантный белок был проанализирован с помощью электрофореза в ПААГ. Его молекулярная масса составляет 9-11 кДа. В зависимости от полученного клона выход рекомбинантного белка от тотального клеточного синтеза колебался в диапазоне от 3 до 10%.
В дальнейшем антигенные свойства были изучены с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Для сравнения был использован цельновирионный препарат вируса ЛХМ, приготовленный по общепринятой методике. В качестве референс-антител применяли сыворотки и моноклональные антитела как иммунизированных вирусом ЛХМ лабораторных животных, так и переболевших и больных пациентов.
Анализ показал, что рекомбинантный антиген по специфичности не уступает, а по чувствительности соответствует природному белку вируса ЛХМ.
В настоящее время проводится оптимизация металл-хелатной хроматографии для максимального очищения пептида с последующим его использованием для получения моноклональных антител и разработки индикационного экспресс-метода.
Область применения: вирусология, лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: рекомбинантный белковый препарат может применяться в качестве антигена для выявления антител к вирусу ЛХМ с помощью ТИФА в диагностических лабораториях ЛПУ РБ.
Предложения по сотрудничеству: производство диагностических тест-систем, поставка рекомбинантного белка в центры гигиены и эпидемиологии.