Cуставной хрящ, поврежденный без затрагивания субхондральной части костной ткани, имеет ограничен­ную способность к регенерации из-за недостатка ло­кальных клеток-предшественников в прилежащих тка­нях. Одним из вариантов регенеративной терапии может быть трансплантация искусственных 3-мерных структур с иммобилизованными, полученными ex vivo стволовы­ми клетками.

Цель работы - создание 3-мерной конструкции-носителя стволовых клеток человека на основе искус­ственного фибринового сгустка для репарации поврежде­ний хрящевой ткани и изучение in vitro хондрогенного по­тенциала клеток в данном микроокружении.

Сущность достижения - определен оптимальный со­став компонентов 3-мерной конструкции-носителя ство­ловых клеток человека на основе искусственного фибри­нового сгустка и протокол дифференцировки мультипо­тентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) и клеток-предшественников хондро­цитов (КПХ) человека в составе 3-мерного матрикса.

Трехмерный матрикс готовили из компонентов гемо­статического препарата «Фибриностат» производства ГУ РНПЦ ГТ - фибриногена и тромбина. Культуру ММСК КМ получали по стандартному протоколу адгезией на пластике мононуклеарной фракции клеток костного моз­га человека, КПХ - методом высева из эксплантов после­операционной хрящевой ткани человека после их предва­рительного протеолитического расщепления.

Анализ экспрессии культурами клеток специфических маркеров хондрогенеза коллагена II типа и аггрекана ме­тодом ПЦР в реальном времени показал, что КПХ экс­прессировали более чем в 10 раз больше аггрекана, чем ММСК КМ. Обе культуры клеток экспрессировали харак­терный для остеогенеза коллаген I типа и практически не экспрессировали коллаген II типа, тогда как для диффе­ренцированных клеток хрящевой ткани наблюдалась про­тивоположная картина. В составе фибриновых конструк­ций КПХ и ММСК КМ сохраняли жизнеспособность, на­блюдался высев клеток из геля аналогично высеву из экс­плантов хрящевой ткани.

Конструкции фибринового геля различной плотности (2 и 8 мг/мл фибриногена), содержащие ММСК КМ чело­века 1-го пассажа и КПХ 4-5-го пассажей с плотностью клеток 5?106/см3 подвергали дифференцировке в хондро­генном направлении по трем различным протоколам с ис­пользованием TGF-?1, TGF-?3, и BMP6 в качестве фак­торов индукции дифференцировки. Хондрогенную диф­ференцировку подтверждали выявлением протеогликанов и гликозаминогликанов по окраске конструкций толуидино­вым синим, сафранином О и альциановым синим с последу­ющей количественной оценкой экстрагированных красите­лей колориметрическим методом. Положительным контро­лем служили образцы послеоперационной хрящевой тка­ни человека. В качестве отрицательного контроля - ана­логичные конструкции, культивировавшиеся в отсутствие факторов хондрогенной дифференцировки.

В ходе дифференцировки наибольшую разницу между опытными и контрольными образцами по экспрессии мар­керов хондрогенной дифференцировки наблюдали при ис­пользовании сочетания дифференцировочных факторов TGF-?3 и ВМР6 как для ММСК КМ, так и для КПХ. По­казано, что TGF-?3 более эффективен чем TGF-?1 при ин­дукции хондрогенеза в фибриновом геле. Заключенные в конструкции большей плотности (8 мг/мл фибриногена), клетки сохраняли хондроцит-подобную морфологию, а продукция гликозаминогликанов и кислых муцинов была в 2-3 раза выше, чем в конструкции с содержанием фи­бриногена 2 мкг/мл. По экспрессии маркеров дифферен­цировки хондрогенез КПХ по сравнению с ММСК КМ был более выражен.

Таким образом, КПХ и ММСК КМ в 3-мерном матрик­се искусственного фибринового сгустка сохраняют жиз­неспособность и могут дифференцироваться в хондроген­ном направлении под воздействием факторов TGF- 3 и ВМР6. Оптимальный состав конструкции - 8 мг/мл фи­бриногена, 1 Ед/мл тромбина, 500 Ед/мл апротинина, кон­центрация клеток - 5?106/см3.